| Аннотация | В статье представлена методика стандартизации анализа SТR-маркеров на примере важного объекта аквакультуры и вместе с тем исчезающего в дикой природе вида - сибирского осетра (Acipenser baerii). Метод позволяет минимизировать погрешность определения длин аллелей микросателлитных локусов при капиллярном электрофорезе благодаря регистрации влияния флуоресцентной метки на электрофоретическую подвижность ампликона - одного из основных факторов, препятствующих выявлению точного, а не оценочного размера ДНК-фрагмента. Был выполнен синтез набора ампликонов известной длины, каждый из которых с одной из сторон имел сайт посадки дополнительного флуоресцентно-меченого праймера. Произведена интеграция флуоресцентной метки в синтезированный набор фрагментов ДНК заданных длин посредством амплификации, в которой использовали единый флуоресцентно-меченый праймер, в качестве ДНК-матрицы выступал набор полученных ранее фрагментов ДНК, а обратный праймер отсутствовал. На образце ДНК сибирского осетра был амплифицирован микросателлитный локус Ls19, при этом прямой праймер был изменен: с 5'-конца вместо флуорофора добавлен сайт посадки меченого праймера, который использовался ранее для окрашивания набора фрагментов ДНК. С помощью раунда амплификации и единого меченого праймера в полученный ПЦР-продуктбыл интегрирован идентичный флуоресцентный краситель По результатам капиллярного электрофореза получили оценочные значения длин фрагментов известного размера, аллелей микросателлитного локуса и коммерческого стандарта длин. Используя корректировку по ампликонам с заранее известными размерами, длину микросателлита определили в 157,8 нуклеотида, при этом оценка только по коммерческому стандарту демонстрировала 156,4 нуклеотида. Контрольное секвенирование выявило длину микро-сателлитного локуса в 158 нуклеотидов. Таким образом, примененный метод существенно (примерно в восемь раз) снизил ошибку измерения длины анализируемого фрагмента ДНК. Представленная методика может применяться как дополнительный метод контроля при генетической паспортизации, а также для быстрого создания референсных образцов и определения длин при сборке аллельных лестниц. Результаты исследования имеют важное значение для мониторинга генетического разнообразия и селекционной работы с осетровыми. |
|---|